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心血管健康机理与模型之降血糖机理的研究

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发表于 2018-1-22 09:32:40 | 显示全部楼层 |阅读模式
心血管健康机理与模型之降血糖机理的研究
功效:降血糖;保护糖尿病肾脏
机理1)提升酶促防御体系的三个酶SOD、CAT和GPx浓度,从而逐渐恢复机体内的防御的平衡,减少自由基的产生,起到保护胰腺组织免受病变和损伤。
          2)通过下调胰腺iNOS组织内的基因表达水平,影响iNOS的活性,减少NO的释放,最终起到清除NO自由基,减少因过量NO而引起的胰腺β细胞凋亡;通过下调胰腺组织内的bax基因(凋亡促进基因)表达水平,上调bcl-2基因(凋亡调控基因)表达水平,阻止和保护胰腺β细胞的凋亡;通过上调PDX-1基因的水平,改变胰岛β细胞功能衰退的状况;通过下调胰腺组织中caspase-3基因的表达水平,阻碍caspase-3介导的细胞凋亡。
         3)通过降低血浆中血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr),并减少尿液中尿糖和尿蛋白的含量,减缓肾脏组织内氧化应激起到保护糖尿病肾脏的作用。
模型:I型糖尿病大鼠
指标:1)大鼠体重;胰腺组织;肾脏组织重量
          2)血糖、血浆总甘油三酯、总胆固醇浓度、NO浓度
          3)血浆中血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)
          4)尿液尿蛋白和尿糖含量
          5)胰腺组织中SOD、CAT和GPx水平
          6)肾组织中SOD、CAT和GPx水平
          7)胰腺β细胞HE染色
          8)胰腺组织关键性基因表达(bax、iNOS、casp-3、bcl-2、PDX-l)
活性成分:灵芝多糖
依据:1)Basnet认为植物多糖降血糖药的作用机制一方面是通过影响激素水平从而促进胰岛分泌胰岛素和修复胰岛β细胞;另一方面是通过影响代谢酶活性的实现的。糖尿病是一种常见的内.分泌疾病,影响着世界上5%的人口。STZ能通过选择性的破坏胰腺β细胞,导致胰岛素分泌绝对缺乏,从而诱导I型糖尿病动物模型,引起高血糖症状。
           2)STZ作为是从strepotomyces acromogenes中提取出来的,它是一种含亚硝基类似物,分子式为Cl4H27N5O12,是现在广泛采用的糖尿病动物模型化学诱导剂。STZ可以选择性地损伤胰岛β细胞,虽然其具体分子机制还没有完全探明,但目前有研究表明STZ依赖于它结构本身存在的类似于糖结构部分可与细胞膜上低亲和力的GLUTZ2结合,特异性损伤β细胞。STZ的毒性可能和产生大量的ROS水平有关,包括释放过氧化氢或者超氧化物自由基;STZ还可以作为NO的一种细胞内供体,通过产生大量的NO,来诱导β细胞凋亡。
          3)糖尿病对机体的危害主要为血管病变所造成的心、脑、肾、眼睛、神经等全身组织和器官损伤。但随着时间的延长,糖尿病肾病已成为糖尿病的严重并发症之一。目前对于糖尿病肾病的发病机制还未有定论,但是有多种可能的病因和发病机制被报道,比如肾小球高滤过,生化代谢紊乱,氧化应激失调,蛋白激酶C活化等。已有研究表明引起的高血糖大鼠在数月后就会出现早期临床糖尿病肾病的一些特征变化,而STZ引起的高血糖也可以作为糖尿病肾病模型。肾脏肥大、血清中血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr),尿液中尿蛋白含量等指标是糖尿病肾病的重要病理特征。
         4)在漫长的生物进化过程中,机体为了防御新陈代谢及其它生命活动中氧自由基的损伤和破坏,在组织和细胞中建立和形成了一套完整的抗氧化防御系统。该防御体系分为酶促与非酶促两个体系,酶促体系包括SOD、GPx、CAT等。它们可以防止新的自由基形成,使得已经存在的自由基转变为无毒分子。正常身体状况下的机体内的防御体系可以起到保护组织避免组织损伤和组织病变。但机体在遭受各种有害刺激时,会引起自由基产生和抗氧化防御直接的失衡,引起防御体系的破坏。
        5)NO是由L一精氨酸在一氧化氮合成酶(NOS)的催化下产生的。NO化学性质活泼,存在时间短。NO与亚铁血红素有很强的亲合力,因此在血液中,NO与红细胞中的血红蛋白结合形成亚硝基血红蛋白而失去活性。iNOS是NOS三种同工酶之一。在不同条件下,NO可呈现出细胞保护和细胞毒性双重效应,它的异常与糖尿病的发生、发展有着密切的关系。有研究表明NO与胰岛β细胞功能下降有关,可能引起胰岛β细胞凋亡。而STZ引起的糖尿病可引起机体内产生大量的NO,NO参与许多自由基级联式反应,从而诱发β细胞凋亡。
       6)细胞凋亡(apoptosis)是一种基因调控的细胞自主死亡过程。细胞凋亡,又称为程序性细胞死亡,它是一种遵循自身程序结束其生命的主动的细胞学过程。研究发现细胞凋亡是在某些生理或者病理因素诱导下,激活信号系统,启动自身内部机制而发生的自然死亡现象。STZ作为一种化学外来物质,经腹腔注射到体内后,可诱导部分胰腺β细胞凋亡,这些凋亡细胞引发机体对β细胞的自身免疫反应,进一步引起更多的β细胞凋亡。凋亡受基因调控,其中最有效的调控物质是bcl-2基因家族,它们在凋亡的基因调控中起着重要作用。Bcl-2是bcl-2家族成员中主要的凋亡因子,在抵抗细胞凋亡及延长细胞寿命方面的作用最具有代表性,而bcl-2家族另一类基因就是凋亡促进基因,bax是很重要的一种。它们形成二聚体,调控蛋白酶和核酸酶活性,双向调节细胞凋亡。二者在细胞中的比例决定了细胞凋亡的走势,当bcl-2蛋白在细胞中过量表达时,与所有bax结合,细胞存活,就会抑制凋亡;当bax过量存在与bcl-2形成异源二聚体,细胞凋亡。
      7)Caspases是一组具有相似氨基酸序列、空间结构和底物特异性的,与秀丽隐杆线虫内细胞死亡基因-3编码产物同源的半脆氨酸蛋白酶,由其引发的级联反应是细胞凋亡过程的中心环节。而caspase家族中的caspase-3是所有凋亡通路的共同下游效应酶。Liadis等通过基因敲除capsase-3基因的小鼠,在STZ处理后无胰岛炎症出现,也不会发生糖尿病。而给予抗caspase-3物质能阻断其活性的,能有效的抑制Fas激发的细胞凋亡。因此,caspase-3在胰岛β细胞凋亡中起着重要的执行作用,也是β细胞凋亡的重要标志物。
     8)PDX-1在发育成熟的机体的胰腺中特异性表达,近年来被认为是内分泌细胞群发育的主要控制基因,其主要是作为转录因子调控胰腺的分化发育、胰岛素基因的转录、胰岛素颗粒成熟和分泌。长期的高血糖可以损伤PDX-1基因,而PDX-1的下调,使得β细胞功能衰退。
实验:
1. 动物分组
将造模成功的糖尿病大鼠随机分成3组(n二10):糖尿病阳性对照组(D),盐酸二甲基双肌组(M)和灵芝多糖组(G)。10只未经造模的SD大鼠为对照组
2. 相关指标变化
1)实验期间大鼠体重变化趋势
结果:40只大鼠腹腔注射STZ后,三天后检测尾部空腹血糖,共30只大鼠被选入动物实验模型。造模成功后的大鼠,大多数出现饮水、进食增多,排尿增多,精神萎靡,形体逐渐消瘦,毛色枯黄,脱毛、活动度低等情况,并且相继有3只大鼠死亡:实验开始后第二周,D组一只大鼠死亡;第三周,M、G组大鼠各死亡一只。可能原因是因血糖过高而导致的代谢衰竭而死。大鼠在灌胃饲养的8周中,C组大鼠体重逐渐递增,D组大鼠开始有略微下降,但之后的体重都没有变化。经Gl-PS和盐酸二甲基双肌灌胃的G组和M组大鼠体重略微增加,但均没有显著变化(P<0.05)(图3.1)。在第8周时,C组大鼠体重要显著高于D、M、G组大鼠(p<0.05)。而G组和M组大鼠体重较D组大鼠均略高,但无统计学差异。
2)GI-PS对大鼠胰腺组织和肾脏组织重量的影响
结果:大鼠饲养8周后,从表3,2可以看出,未经任何处理的D组糖尿病大鼠,胰腺组织重量明显小于C组(p<0.05)。而经盐酸二甲基双肌灌胃的M组大鼠喂养8周后胰腺组织重量显著高于D组(p<0.05)。G组大鼠胰腺重量高于D组,但无统计学意义。胰腺体重比指数D组显著小于c组(p<0.05),而灌胃灵芝多糖后的G组大鼠胰腺体重比指数显著高于D组(p<0.05)不同组别大鼠肾组织重量也有差异。D组大鼠肾脏组织重量略高于C组大鼠,但是没有显著差异。M组和G组大鼠肾脏组织重量高于D组大鼠,M组和D组之间也有显著差异(p<0.05),而G组和D组之间没有显著差异。由于大鼠组别间体重差异较大,肾脏体重比更能反应不同组别大鼠肾脏损伤程度。通过STZ诱导后的糖尿病G、M、D组同C组相比,肾脏体重比均显著增加(P<0.05),而G、M、D组三组之间肾脏体重比没有显著差异。
3)GI-PS对大鼠空腹血糖的影响
结果:经STZ静脉注射的D组大鼠血糖明显高于正常对照组C组(P<0.05)(图3.3)。其中D组大鼠的空腹血糖水平达到了25.00士3.92mmol几。给予GI-PS或者盐酸二甲基双肌8周后,M组和G组大鼠血糖水平显著低于D组大鼠(P<0.05)。G组大鼠血糖水平达到16.61士2.26mmol/L。比,相比D组,血糖低了34%,M组大鼠血糖为13.53士l.82mmol/L,低了46%。但GI-PS降血糖的效果要显著低于盐酸二甲基双肌(P<0.05)。
4)GI-PS对大鼠血浆总甘油三酯、总胆固醇浓度的影响
结果:D组大鼠,血桨中TG和TC水平较C组相比明显升高,TC高了118%,而TG则高了54%。G组和M组大鼠血浆中TG和TC浓度显著低于D组(p<0.05)。M组血浆中TG和TC浓度要显著高于G组(p<0.05)。(表3.3)。糖尿病D组大鼠血浆中的LDL-C浓度显著高于C组大鼠(p<0.05);而灌胃盐酸二甲墓双肌8周后的M组大鼠,LDL-C水平较D组相比显著降低(p<0.05),灌胃灵芝多糖的G组大鼠血浆LDL-C浓度低于D组,但是没有统计学意义(表3.3)。D组大鼠血浆中的HDL-C浓度显著低于正常C组大鼠相比(p<0.05),M组大鼠HDL-C浓度显著高于D组(P<0.05)(表3.3),而G组大鼠血浆中HDL-C水平高于D组,却没有显著差异。
5)GI-PS对大鼠血浆中NO浓度的影响
结果:D组大鼠血浆中NO浓度显著高于C组大鼠(p<0.05),而给以酸二甲基双肌的治疗组M组和G组血桨中的NO浓度显著低于D组(p<0.05)(图 3.4)。
6)GI-PS对大鼠血浆中BUN和Cr的影响
结果:糖尿病D组大鼠血浆中Cr和BUN水平显著高于正常组大鼠C组 (P<0.05)。GI-PS或者盐酸二甲基双胍干预后,M组和G组血浆中Cr和BUN水平显著低于D组大鼠(p<0.05)。
7)GI-PS对大鼠尿液尿蛋白和尿糖含量测定
结果:24h尿糖含量结果见表3.4。由表3.4可以看出正常大鼠尿液里不含有尿糖,但D组大鼠尿液里含有大量的葡萄糖,而两个治疗组M组和G组大鼠24h尿糖含量均低于D组大鼠尿糖含量。M组大鼠24h尿液含有少量尿糖,G组大鼠24尿液含有中量尿糖。I型糖尿病造模成功后的大鼠24h尿液尿蛋白含量达到了109.25士12.2lmg/L,显著高于正常C组大鼠(p<0.05)。M组和G组大鼠24h尿液尿蛋白含量显著低于D组(p<0.05)。这说明Gl-PS和盐酸二甲基双胍可以显著降低糖尿病大鼠24h尿液尿蛋白。
8)Gl-PS对胰腺组织中SOD、CAT和GPx水平的影响
结果:结果显示,糖尿病D组大鼠胰腺组织内的SOD、CAT和GPx水平显著低于C组大鼠(P<0.05);药物干预8周后,G组灌胃Gl-PS和M组灌胃盐酸二甲基双胍的大鼠胰腺组织内的SOD、CAT和GPx水平显著高于D组大鼠(P<0.05)(表3.5)。表明STZ会引起大鼠胰腺组织SOD、CAT和GPx水平的显著升高,而灵芝多糖和盐酸二甲基双胍可以明显降低糖尿病大鼠SOD、CAT和GPx水平。
9)Gl-PS对肾组织中SOD、CAT和GPx水平的影响
结果:D组大鼠肾脏组织内的SOD、CAT和GPx水平显著低于C组大鼠 (P<0.05);G组和M组大鼠肾脏组织内的SOD、CAT和GPx水平均显著高于D组大鼠(表3.6)。这说明,STZ能导致大鼠肾脏组织SOD、CAT和GPx水平明显降低,而灵芝多糖和盐酸二甲基双肌可以明显提高糖尿病大鼠肾脏组织内SOD、CAT和GPx水平。
10)Gl-PS对大鼠胰腺β细胞HE染色的影响
结果:从图3.7中可以观察到,C组正常大鼠,胰岛呈圆形,胰岛β细胞大小一致,核染色质清晰,胞浆界限清楚,淡染细胞质颗粒,细胞呈索状排列;D组模型组胰岛β细胞排列稀疏不均,细胞数量很少,细胞形态不一,溶界消失,胞浆出现空泡,不清晰;M组大鼠经8周灌胃盐酸二甲基双肌后,细胞数量明显提高,与正常大鼠比较,胞浆略有些不均匀,核仁较清晰,细胞排列均匀;G组大鼠胰腺β细胞数量较D组有显著提高,细胞排列均匀。这表明灵芝多糖Gl-PS和盐酸二甲基双胍可以修复和保护STZ引起的胰腺β细胞的病变以及凋
亡。
正常C组大鼠肾脏组织结构清晰,皮质肾小球、肾小管排列规则,肾小球、肾小囊体积正常(图3.8)。静脉注射STZ8周后的D组肾组织肾小球体积明显增大、血管球扩张,肾小囊囊腔变小,近曲小管扩张、管壁变薄.M组大鼠肾脏组织结构较清晰,肾小球、肾小管排列较为规则,肾小球体积稍大,囊腔腔隙较正常,近曲小管结构较D组相比明显清晰,肾小管上皮细胞结构较正常。G组大鼠肾脏组织结构HE切片显示,肾小球、肾小管排列比D组要规则很多,肾小球体积也增大了,近曲小管结构明显清晰许多。这表明灵芝多糖Gl-PS和
盐酸二甲基双肌可以修复和保护STZ引起的大鼠肾脏的病变。
11)Gl-PS对胰腺组织关键性基因表达的影响
结果:通过对胰腺组织中一些凋亡关键性基因进行的RT-PCR测定,以对照组C组为标准1计算得出结果见图3.9。D组的大鼠经静脉注射STZ后,胰腺组织中bax、iNOS和casp-3基因表达量显著高于C组(p <0.05),分别达到正常对照组2.05士0.09倍、3,29士0.13倍和4.02士0.13倍:而bcl-2和PDX-l基因表达显著低于C组(p<0.05),分别只有对照组的0.49士0.09和0.25士0.06倍。但灌胃Gl-PS或者盐酸二甲基双肌可以上调或者下调这些基因。同D组大鼠胰腺组织相比,G组和M组胰腺组织中bax、iNOS和casp-3的基因表达水平要显著低,而bc-2和PDX-1则要显著高于D组。
3.结论
研究结果显示,灵芝多糖Gl-PS对STZ诱导的糖尿病大鼠有一定的降低血糖、减低血浆中TC、LDL-C、TG和增加血浆中HDL-C浓度的作用,并能减少糖尿病大鼠尿糖和尿蛋白的产生。并通过胰腺组织切片分析、胰腺重/体重比值、胰腺组织中酶促抗氧化剂SOD、CAT和GPx的水平变化,以及胰腺组织中凋亡相关的casp-3、bcl-2、bax等关键基因的表达水平的。研究灵芝多糖通过阻止胰腺p细胞的凋亡,保护和修复大鼠胰腺细胞从而达到降低血糖的作用。另一方面,灵芝多糖可以通过减缓肾脏组织内氧化应激起到保护糖尿病肾脏的作用。


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