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柴胡皂苷对抑郁模型大鼠行为及海马Caspase-3、Caspase-9蛋白表达的影响

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发表于 2018-1-8 09:26:25 | 显示全部楼层 |阅读模式
柴胡皂苷对抑郁模型大鼠行为及海马Caspase-3、Caspase-9蛋白表达的影响
功效:抗抑郁
机理:
通过抑制Caspase级联反应的启动性蛋白酶Caspase-9,阻止Caspase级联反应启动,抑制下游凋亡执行蛋白Caspase-3的激活,进而有效缓解抑郁症状。
指标:
1、活性物连续给药对模型小鼠敞箱实验的影响;
2、活性物连续给药对模型小鼠糖水消耗实验的影响;
3、活性物连续给药对模型小鼠海马组织Caspase-3蛋白表达的影响;
4、活性物连续给药对模型小鼠海马组织Caspase-9蛋白表达的影响。
活性成分:柴胡皂苷
依据:
1、Caspase是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶,能够高度选择性地切割某些蛋白质,切割的结果或是活化某种蛋白,或使某种蛋白失活,但从不完全降解一种蛋白质。在人类细胞中有大约十几中Caspase每个酶作用都有稍微不同。这些caspases中,caspase-1caspase-11,以及可能还有caspase-4被认为不直接参与凋亡信号的转导,它们主要参与白介素前体的活化caspase-2caspase-8caspase-9caspase-10参与细胞凋亡的起始;参与细胞凋亡执行的则是caspase-3caspase-6caspase-7,其中caspase-37具有相近的底物和抑制剂特异性它们降解PARPDFF-45DNA fragmentation factor-45),导致DNA修复的抑制并启动DNA的降解。
2、caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶,也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用,caspase-3基因转染昆虫Sf9细胞后引起细胞凋亡,这个过程可以被Bcl-2阻断;在发生凋亡的细胞提取液中去除caspase-3后,这些提取液就失去了诱导细胞凋亡的能力;再加入纯化的caspase-3它又能恢复致凋亡的功能。caspase-3可以被多种因素活化,在CTL细胞的杀伤作用中,它既可被Fas/FasL途径活化,也可以通过颗粒酶B途径活化。
3、Caspase-9Caspase级联反应的启动性蛋白酶,死亡受体接受信号后,引起pro-Caspase-9激活,并启动Caspase级联反应,激活其下游的Caspase-3Caspase-9是细胞凋亡信号通路上天然存在的人类蛋白,无免疫源性,Caspase-9参与线粒体依赖途径诱导细胞凋亡,具有非常重要的作用。


【实验】
1  实验材料
1.1 动物
SD雄性大鼠,清洁级,23月龄,由大连医科大学动物实验中心提供,许可证号:SCXK(辽)2008-0002
1.2 动物分组
清洁级雄性SD大鼠,不限制食水,适应性喂养1周,环境安静,干燥,通风。进行敞箱实验评分后,选取评分相近的60只大鼠,随机分为对照组、模型组、氟西汀组及柴胡皂苷组共4组,每组15只。
1.3 造模及给药
除对照组外,模型组、氟西汀组及柴胡皂苷组均单笼孤养,同时进行21d的慢性不可预见应激刺激。包括夹尾(60s)、高速水平震荡(60s)、禁食(48h)、禁水(24h)、悬吊(15min)、冷刺激(4℃,5min)、热刺激(45℃,5min)、昼夜颠倒(24h)。从造模第2天开始各组大鼠进行灌胃给药,氟西汀组给予氟西汀(1.2mg/kg),柴胡皂苷组给予柴胡皂苷(25mg/kg),对照组及模型组给予等体积的生理盐水,每天管委1次,连续21d。

2  实验方法
2.1 敞箱实验
实验21d对各组大鼠进行敞箱实验行为学评分。准备一高40cm、宽80cm的正方形纸板箱,箱内四壁涂黑,地面平均画出25cm的正方形区域。在安静环境内将大鼠放入箱内,记录3min内大鼠经过的正方形区域数量、直立次数、修饰次数。每只大鼠测试前用10%的乙醇清理纸箱。

2.2 糖水消耗实验
于敞箱实验结束后,对各组大鼠进行糖水消耗实验。各组大鼠分别给予固定量1%蔗糖水、纯水各1瓶。记录24h后2瓶水的消耗情况。根据公式计算糖水偏爱度。

2.3 免疫组化法检测大鼠海马组织Caspase-3、Caspase-9蛋白表达
行为学测试结束后,断头处死大鼠,立即冰上开颅,取海马组织,一侧-80℃冻存备用,另一侧海马经固定包埋后,石蜡切片脱蜡水化后进行抗原修复。分别孵育氧化酶阻断剂,动物血清,一抗,二抗,连霉菌素-过氧化物酶.经DAB显色,苏木素复染,PBS返蓝后,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。每块海马组织取5张切片,每切片光镜下取10个无重复视野,经形态分析软件对图像分析处理,测出 Caspase-3和Caspase-9蛋白抗原表达的总面积,阳性细胞数和平均吸光度A,计算其积分吸光度(IA)。

2.4  RT-PCR法检测大鼠海马区 Caspase-3、Caspase-9mRNA含量
取冻存的海马组织剪碎,加入1mLTrizol冰上匀浆。按RNAiso Reagent试剂盒说明步骤提取海马组织总 RNA。琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检查RNA浓度,完整性。按STBR ExScriptTM 实时定量PCR Kit 反转录试剂盒说明步骤进行反转录,反转录反应42℃,15 min,反转录酶失活反应95℃,2min。按SYBR Premix Ex Taq (Prefect Real Time)kit试剂盒25μL反应体系进行PCR反应。


3 结果
3.1各组大鼠行为学评价结果
敞箱实验检测大鼠行为学改变。与对照组相比,模型组大鼠糖水偏爱度,水平与垂直运动得分,修饰次数均明显降低(P<0.05);与模型组比较,氟西汀组和柴胡皂苷组大鼠糖水偏爱度,水平与垂直运动得分,修饰次数均明显升高(P<0.05)。

3.2 各组大鼠海马区caspase-3,caspase-9蛋白表达结果
与对照组比较,模型组大鼠海马区 Caspase-3,Caspase-9蛋白表达积分光密度增加(P<0.05);与模型组比较,柴胡皂苷组,氟西汀组大鼠海马Caspase-3,Caspase-9表达明显降低(P<0.05)。

3.3 柴胡皂苷对大鼠海马区Caspase-3和Caspase-9 mRNA 表达的影响
与对照组比较,模型组大鼠海马区 Caspase-3,Caspase-9 mRNA表达量增加(P<0.05),与模型组比较,氟西汀组与柴胡皂苷组 Caspase-3,Caspase-9基因表达均下调(P<0.05)。


4  结论
实验中我们对大鼠采用长期慢性不可预见性应激刺激复制抑郁模型,并通过旷场试验,糖水消耗实验及修饰次数检测大鼠造模效果.经过21d CUMS,模型组大鼠水平与垂直运动得分、糖水偏爱度及修饰次数各项指标明显降低,而给予柴胡皂苷的大鼠表现为运动能力逐渐恢复,达到改善抑郁症状的作用,效果与氟西汀相当。
Caspase为半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶,其蛋白家族介导的细胞发生凋亡的级联通路,通过多种因子的作用被激活,经过一系列的级联反应最终导致细胞凋亡发生。Caspase-9是Caspase级联反应的启动性蛋白酶,死亡受体接受信号后,引起pro-Caspase-9激活,并启动Caspase级联反应,激活其下游的Caspase-3。Caspase-3是细胞凋亡的终末剪切酶,与DNA修复、基因完整性监护有关。本实验中模型组大鼠Caspase-3及Caspase-9均呈现高表达,提示抑郁的发生可能是通过激活凋亡内外途径中的上游蛋白 Caspase-9,从而起到激活下游凋亡执行蛋白Caspase-3而产生促进细胞凋亡的作用。造模后的大鼠给予柴胡皂苷后,Caspase-3,Caspase-9表达明显受到抑制。前期研究结合本实验结果,说明柴胡皂苷可以有效缓解抑郁症状,并可能阻止抑郁发生与进展,其作用机制可能与抑制 Caspase-3,Caspase-9表达有关。



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