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TREK-1钾通道拮抗剂对CUMS大鼠抑郁行为及海马DG区神经再生的影响

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发表于 2018-1-2 09:36:07 | 显示全部楼层 |阅读模式
TREK-1钾通道拮抗剂对CUMS大鼠抑郁行为及海马DG区神经再生的影响
功效:抗抑郁
机理:
TREK-1通道拮抗剂通过特异性结合钾通道,抑制钾通道活性,或是阻断钾通道电流,引起细胞膜点位变化,显著改善大鼠的抑郁样行为,逆转抑郁症大鼠海马DG区降低的神经再生,且括抗剂的抗抑郁效应的出现及促神经再生的能力都优于经典抗抑郁药。
指标:
1CUMS刺激与抗抑郁治疗对各组大鼠体质量改变的影响
2CUMS刺激与抗抑郁治疗对各组大鼠糖水消耗百分比的影响
3CUMS刺激与抗抑郁治疗对各组大鼠强迫游泳不动时间的影响
4CUMS刺激与抗抑郁治疗对各组大鼠旷野实验中行为学的影响
5、抗抑郁药物干预对大鼠海马DG区细胞増殖的影响
6、抗抑郁药物干预对大鼠海马DG区新生细胞分化的影响
7、抗抑郁药物干预对大鼠海马DG区新生细胞凋亡的影响
活性成分:SID1900Spadin
依据:
1、TWIK相关钾离子通道亚型1TREK-1)是目前研究最为广泛和深入的一类双孔钾离子通道,其跨膜区含四次跨膜片段(M1-M4)和两个孔道结构域(P1P2),串联在一起,以二聚体形式发挥生物学作用。TREK-1表达于机体多种组织,以中枢神经系统最为丰富,参与调节细胞的兴奋性,改变细胞的渗透压与体积,在细胞的增殖、分化和组织器官发育过程发挥重要作用。TREK-1钾通道在生理条件下可自发产生电流,具有外向整流特性,因此也被称为“背景性电流”或“漏电流”,这一电流具有时间依赖性和电压依赖性,对促进细胞膜超极化,维持静息膜电位,控制动作电位时程以及递质释放具有重要作用。TREK-1基因敲除(Kcnk2-/-)鼠的出现确立了此通道的直接抗抑郁作用,Heurteaux研究组发现未予任何处理的Kcnk2-/-鼠体现出明显的“抗抑郁表型”,Kcnk2-/-鼠在一系列行为学实验中的表现与接受短期氟西汀抗抑郁治疗的野生型抑郁小鼠类似。电生理研究发现,Kcnk2-/-鼠中缝核5-HT能神经元平均放电活动明显増加,5-HT能神经传递效能显著增强,这与经TREK-1通道拮抗剂系统治疗的野生型小鼠放电活动类似,有研究认为,敲除TREK-1后,机体cAMP含量减少,其下游PKA活性降低,5-HT对突触前膜神经元的负反馈环路被抑制。以上研究充分说明,TREK-1通道不完全是通过影响神经元膜电位水平来发挥抗抑郁作用,很可能还参与5-HT以及HPA轴的负反馈调节通路而发挥抗抑郁作用。
2、5-羟色胺,最早是从血清中发现的,又名血清素,广泛存在于哺乳动物组织中,特别在大脑皮层质及神经突触内含量很高,也是一种抑制性神经递质。五轻色胺能系统来源于大脑深部,福射到几乎整个大脑,调节多个领域的情感、思维和行为活动。早期抗抑郁药的药理作用机制大多是通过阻断突触前神经元对5-HT的再摄取,增加突触间隙5-HT的含量和利用率,从而提高突触后神经元的兴奋性,发挥抗抑郁作用。单胺氧化酶(MAO)抑制剂通过抑制单胺氧化酶的活性,减少单胺类递质的氧化降解,间接増加有效介质的浓度,弥补突触间隙中不足的单胺类神经递质而发挥抗抑郁作用。
3、下丘脑-垂体-肾上腺轴,也被叫做边缘系统-下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴),是一个直接作用和反馈互动的复杂集合,包括下丘脑、脑垂体以及肾上腺。HPA轴是神经内分泌系统的重要部分,参与控制应激的反应,并调节许多身体活动,如消化,免疫系统,心情和情绪,性行为,以及能量贮存和消耗。从最原始的有机体到人类,许多物种,都有HPA轴。它是一个协调腺体,激素和部分中脑(特别是参与介导一般适应综合征 (GAS)的中脑区域)相互作用的机制。
4、一直以来,海马被认为是参与机体学习和记忆过程的重要结构,但愈来愈多的实验证据表明,海马还参与机体的应激和情绪情感调节反应,是长期应激刺激后脑内极易受损伤的部位。磁共振成像Meta化分析显示,抑郁症患者与抑郁模型动物海马体积较正常个体明显缩小,脑裂增宽、扩大,脑沟加深,脑内神经元树突分支数量减少、长度降低,突触前活性带长度以及突触后致密物厚度显著缩小。研究证实,抗抑郁治疗后,上述神经生物学改变得到明显逆转。因此,我们认为海马区神经细胞再出的改变可能与抑郁症的发病与抗抑郁治疗效果的评价密切相关,功能性神经细胞的萎缩、变性、丢失和受抑制的神经再生可能参与了抑郁症的发病过程。
5、2010年法国尼斯大学Heurteaux等研究组发现spadin可特异性结合细胞膜表面TREK-1钾离子通道,抑制通道活性,连续4天静脉注射spadin可显著逆转小鼠的抑郁样行为。Spadin 是一个强效的TREK-1 抑制剂,这是一个分泌的多肽,它来自由成熟的NTSR3/Sortilin 生成的前导肽。在TREK-1 转染的COS-7细胞中,100nM Spadin 能够抑制63% 的由花生酸刺激产生的TREK-1电流。在野生型小鼠脑切片的CA3海马神经元上, Spadin 也可以阻碍TREK-1 的活性。
6、本实验室前期研究人员通过利用铊离子巧光高通量筛选技术在中国科学院上海药物研究所筛选出化合物——SID1900,进一步细胞实验己证实该化合物可阻断TREK-1通道电流,引发细胞膜电位变化。本研究从动物实验层面进一步证实该化合物在阻断TREK-1钾通道电流后引起的机体行为学变化,并从时间维度探讨其对实验动物行为学改变的影响。

【实验】
1  实验材料
1.1动物
SPF级成年雄性SD大鼠,体重220±10g,由北京维通利华生物公司提供。饲养于中国科学院深圳先进技术研究院实验动物中心。自由进食饮水,室温24±1℃、湿度55%±10%、12h明-暗循环光照(光照时间为8:0020:00),环境安静。动物饲养实验处理遵守国家健康指导中屯发布的实验动物管理及使用规定,实验过程中尽量减少实验动物使用量,处死动物时减少其所受痛苦。
1.2 分组
适应期结束后对进入实验的所有动物随机分为两个大组,正常组和模型组。正常组随机分为四个亚组:正常对照组(controlsalineCON)、正常+氟西汀组(controlfluoxetineCONFLU)、正常+spadin组(controlspadinCONSPA)和正常+SID1900组(controlSID1900CONSID)。模型成功的大鼠随机分为模型对照组(CUMSsalineCUMS)、模型+氟西汀组(CUMSfluoxetineCUMSFLU)、模型+spadin组(CUMSspadinCUMSSPA)、模型+SID1900组(CUMSSID1900CUMSSID)。整个实验周期中经模型刺激未抑郁的大鼠归为一组(NO CUMS)。

2  实验方法
2.1 抑郁症动物模型建立
适应性喂养一周后,根据行为学检测结果结合体质量变化,筛选行为表现及体重相近的大鼠进行实验。参照Jayatissa等的造模方法并稍加修改,CUMS刺激结合孤立饲养方法建立大鼠抑郁症动物模型。每日随机给予一种应激刺激,相同刺激不连续出现,使动物不能预料刺激的发生,免产生适应性反应。应激刺激28天后,根据行为学表现对抑郁症动物进行筛选,将具有典型抑郁症行为学表现的大鼠纳入模型组并接受后期药物治疗处理,同时,造模未成功的大款继续饲养并接受模型刺激及行为学评估作对比观察。药物治疗时间为28天,模型给药组动物仍接受应激刺激。
2.2 糖水偏好实验
   参照文献,实验开始前训练所有动物适应并学习饮用蔗糖水。第一个24h每笼放置两瓶1%蔗糖水;第二个24h每笼放置一瓶1%蔗糖水和一瓶实验动物饮用纯水,12h后更换两瓶左右位置。第三个24h每笼放置两瓶实验动物饮用纯水。适应结束后间隔一天,行糖水偏好实验检测。所有动物均接受单笼饲养并同时给予预先称量好的两瓶水:一瓶1%蔗糖水,另一瓶实验动物饮用纯水,12h后更换两瓶位置,24h后取走两瓶并称重。
2.3 旷野实验
参照Benelli等方法将大鼠放入长宽高为100cm100cm60cm的四壁白色、箱底黑色的不透明敞箱的中央区域,录像系统自动记录大鼠5min内的行为表现,测定结束后清除动物粪便,并用75%酒精清洗箱底及四壁,再对下一只动物进行测试,整个试验过程在安静的环境中进行。
2.4 强迫游泳实验
    参照Cryan等的描述,首先向透明圆柱形(高50cm,直径30cm)水桶内注入温度(23±1℃),深度3033cm的清水,将大鼠放入其中,每桶一只。使大鼠在水中既不能后爪触底支撑身体,又不能跳动后前爪攀附桶壁。记录大鼠在水中的累计静止时间,即大鼠在水面漂浮不动或保持头部露出水面仅有肢体轻微活动W维持身体平衡的时间。录像系统自动记录大鼠6min的行为表现,分析后5mm内大鼠在水面的累计不动时间,作为判断抑郁严重程度和抗抑郁药物起效与否的指标。每只大鼠单独测试,清洁桶壁更换清水后再检测下一只。实验开始前一天对每只大鼠进行15min的游泳训练。分别在模型建立后第3037445158天测定不动时间,建模前测量基线值作对照。
2.5 海马DG区神经细胞再生的检测
最后一次行为学检测结束24小时后,连续3天腹腔往射BrdU溶液(50mg/KG//次),每日两次,间隔12小时,以标记新生细胞。最后一次腹腔注射BrdU24小时后,快速断头,并迅速取出脑组织放入4%PFA溶液中,进行后固定,4℃存放24小时。
(1)SABCFITC方法免疫姐织化学染色
(2)NeuNBrdUgfapBrdU免疫巧光双重标记
(3)TUNEL/BrdU荧光检测

3  结果
3.1  CUMS刺激与不同时间抗抑郁治疗对各组大鼠体质量的影响
4周的CUMS模型刺激较正常组可显著降低大鼠的体质量(P<0.001)。正常给药处理对大鼠的体质量无明显影响,且整个实验周期中模型刺激后未抑郁的大鼠体质量较正常组大鼠差异无统计学意义(P>0.05);与CUMS组相比,CUMSSID组在药物处理7天后体质量即显著增加(P<0.01),随给药时间延长,这种影响越明显;CUMSFLU组在给药28天后,体质量显著回升(P<0.05);自给药14天起,CUMSSID组体质量水平较CUMSFLU组明显增高,差异有显著性(P<0.05)。

3.2  CUMS刺激与抗抑郁治疗对大鼠糖水消耗百分比的影响
不同类型抗抑郁药物治疗对未接受模型刺激大鼠的糖水消耗比例无显著性影响(P>0.05)。药物干预7天后,CUMSSPA组大鼠糖水消耗比例较CUMS组显著增加(P<0.001),与CUMSFLU组和CUMSSID组相比,差异有统计学意义(P<0.01);药物处理14天后,与CUMS组相比,CUMSSPA组与CUMSSID组动物糖水消耗百分比明显增加(P<0.05,P<0.01);抗抑郁治疗21天后,CUMSFLU组降低的糖水消耗百分比出现回升趋势(P>0.05);药物治疗28天后,各模型给药组糖水消耗比例较CUMS组显著增加(P<0.001),但组间比较差异无显著性(P>0.05)。

3.3  CUMS刺激与抗抑郁治疗对大鼠强迫游泳不动时间的影响
模型组大鼠抗抑郁治疗7天后,CUMSSPA亚组不动时间较CUMS组明显减少(P<0.05);当药物干预14天后,CUMSSID组动物在水面的不动时间较CUMS组亦明显缩短,与CUMSFLU组相比,CUMSSPA组与CUMSSID组大鼠的不动时间差异有显著性(P<0.001,P<0.01);药物治疗28天后,CUMSFLU组在FST中的不动时间较CUMS组显著减少(P<0.001),此时,CUMSSPA组与CUMSSID组动物累计不动时间与CUMSFLU组相比差异有显著性(P<0.001)。与CON组相比,NO CUMS组动物在水面的漂浮不动时间自给药处理14天后即呈现明显上升趋势。

3.4  CUMS刺激与抗抑郁药物治疗对大鼠海马DG区细胞増殖的影响
    与正常组相比,CUMS模型刺激可显著降低大鼠海马DG区新生细胞的数量(P<0.01),长期spadin抗抑郁治疗,可增加正常大鼠海马DG区新生细胞数量(P<0.05);不同抗抑郁药物治疗均可显著逆转模型刺激所致海马新生细胞数量的减少(P<0.001),但各给药亚组组间差异无统计学意义。

3.5  CUMS刺激与抗抑郁药物治疗对各组大鼠DG区新生细胞分化的影响
    CUMS模型对照组海马DG区新生细胞向胶质细胞方向的分化比例较CON组明显增加(P<0.05),而向神经元方向分化比例显著降低(P<0.001);与CON组相比,抗抑郁治疗对正常大鼠新生细胞的分化无明显影响,但TREK-1钾通道抗抑郁处理后海马DG区新生细胞向神经元方向分化的比例存在明显上升趋势,而向胶质细胞方向的分化比例则表现出降低趋势,差异均无统计学意义(P>0.05);与CUMS组相比,4周抗抑郁治疗可显著增加DG区新生细胞中成熟神经元所占的比例CUMSFLU组,CUMSSPA组及CUMSSID组显著性为:P<0.01,P<0.001,P<0.001),降低胶质细胞分化百分比(P<0.05),差异有显著性。

3.6  CUMS剌激与抗抑郁药物治疗对各组大鼠DG区新生细胞凋亡的影响
CON组相比,CUMS模型刺激可虽著增加海马DG区新生细胞的调亡比例(P<0.001);抗抑郁治疗4周后CUMSSPA组及CUMSSID组海马DG区细胞调亡比例较CUMS组明显减少,差异有显著性(P<0.01)。药物处理对未接受模型刺激的SD大鼠海马DG区新生细胞的调巳无显著性影响(P>0.05),巧TREK-1钾通道拮抗剂处理组新生细胞中调巳细胞所占比例存在降低趋势(P>0.05)。

4  结论
本研究从"神经再生障碍假说"角度,探讨了新型TREK-1钾通道拮抗剂(spadin和本实验室筛选出的SID1900)与传统抗抑郁药(氣西汀)对正常大鼠及CUMS模型刺激大鼠的行为学改变的实效性影响。研究显示不同类型抗抑郁药对正常大鼠的行为学改变无明显影响,TREK-1钾通道括抗剂治疗两周后抑郁症动物的糖水消铸比例较模型对照组明显回升,强迫游泳实验中不动时间显著缩短,并且旷野实验中运动能力明显增加,表现出较强的抗抑郁作用,而氣西汀治疗四周后,以上抗抑郁作用才得以体现。其次,CUMS模型刺激可显著降低大鼠海马DG区神经再生能力,而抗抑郁治疗明显逆转了这一神经再生障碍,尤其在新生神经细胞分化和凋亡比例上。经TREK-1钾通道枯抗剂治疗后海马DG区新生细胞向神经元方向分化比例明显増高,而向胶质细胞分化比例以及细胞调亡比例显著降低,说明TREK-1钾通道枯抗剂作为新一代抗抑郁药,其早期快速抗抑郁作用的发挥可能与增加的海马神经元分化比例和降低的新生细胞调亡有关。



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